Une classe des endonucléases qui clive l'ADN après avoir reconnu une séquence spécifique, par exemple, Bam H1 (5´GGATCC3´), dIII Eco RI (5´GAATTC3´) et Hin (5´AAGCTT3´). Il y a trois types d'enzymes de l'endonucléase de restriction :

Type I: coupe non spécifiquement une distance supérieure à 1000 bp de sa séquence de reconnaissance et contient des activités de restriction et de méthylation.

Type II : Coupes à ou près d'un court et souvent palindromiques (q.v.), séquence de reconnaissance. A séparé enzyme méthyle la même séquence de reconnaissance. Ils peuvent faire les coupes dans les deux brins d'ADN exactement en face de l'autre et générer émoussés se termine, ou qu'ils peuvent apporter des coupes décalées pour générer les extrémités cohésives. Le type II enzymes de restriction sont ceux couramment exploitées dans la technologie de recombinaison de l'ADN.

Type III : coupe bp 24-26 en aval d'une séquence de reconnaissance courtes, asymétrique. Nécessite l'ATP et contient des activités de restriction et de méthylation.